Caracterización cinética y molecular de nicotin desaminasas y aldolasas mediante enzimas acopladas = Kinetic and molecular characterization of nicotin deamidases and aldolases using couple enzymes

Abstract

Palabras Clave: Ácido N-acetilneuramínico aldolasa, enzima acoplada, cinética, ensayo espectrofotométrico, lactato deshidroganasa, evolución dirigida, nicotinaminidasa, glutamato deshidroganasa, nicotinamida mononucleotido desaminasa, modelado de estructuras protéicas, filogenia, mutagénesis, metabolismo NAD.

Resumen en Español: El objetivo de esta tesis fue la búsqueda de nuevas aldolasas y nicotin desaminasas bacterianas con características mejoradas para la producción de compuestos con interés farmacéutico y biotecnológico. En primer lugar, se clonó y caracterizó una ácido N-acetilneuramínico aldolasa de Lactobacillus plantarum, que se utilizó como molde para la creación de librerías de evolución dirigida. Se desarrollo un método de ensayo de alto rendimiento para esta librería de evolución dirigida, utilizando una L-lactato deshidrogenasa de Bacillus halodurans como enzima acoplada. 2 nuevas enzimas involucradas en el metabolismo del NAD se clonaron y caracterizaron: una nicotinaminidasa y una nicotinamida mononucleótido (NMN) desaminasa, ambas obtenidas del extremófilo Oceanobacillus iheyensis HTE831. Se desarrollo también un método de cribado de alto rendimiento para nicotinaminidasas, basado en el uso de una glutamato deshidrogenasa clonada de Bacillus halodurans. Además, se describió por primera vez un método de medida espectrofotométrico para la NMN desaminasa.

Resumen en Inglés: The main objective was the search for new bacterial aldolases and nicotin deamidases with improved characteristics for the production of compounds with pharmaceutical and biotechnological interest. In first instance, the cloning and characterization of the novel N-acetylneuraminic acid aldolase from Lactobacillus plantarum was achieved and it was used as template for directed evolution experiments. A high-throughput screening method for this directed evolution library was developed using a novel L-lactate dehydrogenase from Bacillus halodurans as coupling enzyme. Two novel enzymes involved in the NAD+ metabolism were also cloned and characterized: a nicotinamidase and a nicotin mononucleotide (NMN) deamidase, both from the extremophile Oceanobacillus iheyensis HTE831. A high-throughput screening method for nicotinamidases was also developed, based on the use of a cloned glutamate dehygrogenase from Bacillus halodurans. Furthermore, a novel spectrophotometric screening method was described for the first time for the enzyme nicotinamide mononucleotide deamidase.